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ELISA 實驗的注意事項

2025-07-01 [140]

試劑的準備

按試劑盒說明書的要求準備實驗中需用的試劑。ELISA中用的蒸餾水或去離子水,包括用于洗滌的,應為新鮮的和高質(zhì)量的。自配的緩沖液、洗滌液應用pH計測量。從冰箱中取出的試驗用試劑應待溫度與室溫平衡后使用,一般室溫平衡不低于30min。試劑盒中本次試驗不需用的部分應及時放回冰箱保存。

加樣

在ELISA中一般有3次加樣步聚,即加標本,加酶結(jié)合物,加底物。加樣時應將所加物加在LEISA板孔的底部,避免加在孔壁上部,并注意不可濺出,不可產(chǎn)生氣泡。

加標本一般用微量加樣器,按規(guī)定的量加入板孔中。每次加標本應更換吸嘴,以免發(fā)生交叉污染,也可用一次性的定量塑料管加樣(一般不建議使用)。有些指標檢測(如間接法ELISA)需用稀釋的血清,可在試管中按規(guī)定的稀釋度稀釋后再加樣。也可在板孔中加入稀釋液,再在其中加入血清標本,然后在微型震蕩器上震蕩1min。加酶結(jié)合物工作液和底物工作液時可用多道移液器,使加液過程在最短時間內(nèi)完成。

保溫

在ELISA中一般有兩次抗原抗體反應,即加標本和加酶結(jié)合物后??乖贵w反應的完成需要有一定的溫度和時間,這一保溫過程稱為溫育(incubation),有人稱之為孵育。

ELISA屬固相免疫測定,抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生。以抗體包被的夾心法為例,加入板孔中的標本,其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結(jié)合的機會,只有最貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個逐步平衡的過程,因此需經(jīng)擴散才能達到反應的終點。在其后加入的酶標記抗體與固相抗原的結(jié)合也同樣如此。這就是為什么ELISA反應總是需要一定時間的溫育。

溫育常采用的溫度有43℃、37℃、室溫和4℃(冰箱溫度)等。37℃是實驗室中常用的保溫溫度,也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度。在建立ELISA方法作反應動力學研究時,兩次抗原抗體反應一般在37℃經(jīng)1-2小時,產(chǎn)物的生成可達。為加速反應,可提高反應的溫度,有些試驗在43℃進行,但不宜采用更高的溫度??乖贵w反應4℃,在放射免疫測定中多使反應在冰箱中過夜,以形成最多的沉淀。但因所需時間太長,在ELISA中一般不予采用。

保溫的方式除有的ELISA儀器附有特制的電熱塊外,一般均采用水浴,可將ELISA板置于水浴箱中,ELISA板底應貼著水面,使溫度迅速平衡。為避免蒸發(fā),板上應加蓋,也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔,此時可讓反應板漂浮在水面上。若用保溫箱,ELISA板應放在濕盒內(nèi),濕盒要選用傳熱性良好的材料如金屬等,在盒底墊濕的紗布,最后將ELISA板放在濕紗布上。濕盒應先放在保溫箱中預溫至規(guī)定的溫度,特別是在氣溫較低的時候更應如此。為避免酶標板底部受水汽或磨損導致的讀數(shù)誤差,一般采用鼓風恒溫箱保溫,這個過程必須在酶標板上方貼封紙,以免蒸發(fā)。無論是水浴還是濕盒溫育,反應板均不宜疊放,以保證各板的溫度都能迅速平衡。室溫溫育的反應,操作時的室溫應嚴格限制在規(guī)定的范圍內(nèi),標準室溫溫度是指20-25℃,但具體操作時可根據(jù)說明書的要求控制溫育。室溫溫育時,ELISA板只要平置于操作臺上即可。應注意溫育的溫度和時間應按規(guī)定力求準確。為保證時間精確,一個人一次不宜多于兩塊板同時操作、測定。

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